羊駝免疫產生高水平的納米抗體——動物免疫
動物產生抗體的機理：抗原免疫動物→激活B細胞→轉化成漿細胞→分泌針對抗原的特異性的抗體。抗體產生是從抗原刺激免疫動物產生強烈免疫應答開始的，離不開高效的動物免疫，實際操作中以檢測血清中抗體效價來衡量實際免疫效果[1]。
動物免疫中的抗原
為了制備特異性強，效價高，親和力好的優質免疫抗體，首選必須要有合適的抗原。抗原的基本特性包括免疫原性和反應原性。免疫原性是指某抗原能作用于T細胞、B細胞的抗原識別受體，進而誘導機體產生免疫應答的特性。反應原性是指抗原與相應的抗體發生特異性結合的特性, 此特性又稱為免疫反應性。抗原的反應性取決于抗原決定簇，或稱為表位，是抗原與抗體分子特異結合的區域，一個抗原分子可帶有不同的決定簇[2]。反應原性與抗原決定簇的性質、空間、位置、立體構象以及種屬差異等密切相關。而免疫源性與抗原本身的多種因素相關[3-6]，包括：
異源性：自體或自身抗原通常免疫原性較差，抗原與宿主生物之間的異源性越大，免疫反應越強。
分子大小：抗原分子量越低 ，其免疫原性相對偏弱。例如，分子質量大于100,000 Da的分子通常是活躍的免疫原，而小于5,000-10,000 Da的分子則免疫原性較差。
化學性質和組成：抗原主要是由蛋白質、多糖、脂質或核酸組成的。蛋白質具有最強的免疫原性，其次是多糖；而脂質與核酸一般并不能成為免疫原，常常要借由與蛋白質結合才能激活免疫應答反應。一般來說，物質的化學成分越復雜，其免疫原性就越強。
降解性：易被吞噬的抗原通常更具免疫原性，這是因為對于大多數抗原（T依賴性抗原），免疫反應的發展要求抗原被APC吞噬、處理并呈遞給輔助性T細胞。
根據抗原的免疫原性與反應原性，抗原可分類為完全抗原與不完全抗原。完全抗原既具有免疫原性又有反應原性[7]。不完全抗原只具有反應原性而缺乏免疫原性, 亦稱為半抗原[8]。半抗原單獨作用于機體的免疫系統時無免疫原性，當與蛋白載體結合形成半抗原-載體偶聯物時，即可獲得免疫原性。例如，合成肽抗原通常太小而不能刺激宿主免疫系統產生顯著的免疫應答，需與KLH、BSA、OVA等載體蛋白交聯后成為完全抗原才能刺激宿主產生相應的抗體。需要注意的是，這種偶聯物不但可刺激機體的免疫系統產生針對半抗原的抗體，也可以刺激機體產生針對蛋白質載體的抗體，因此在抗體篩選時需再偶聯另一種不同的載體蛋白進行篩選。
為了達到更好的免疫效果以獲得高質量的抗原特異性抗體，除了抗原本身的性質，免疫過程中的操作和免疫動物的選擇等因素也至關重要。
抗原制備和乳化
免疫用的抗原一般為溶液和凍干粉兩種形式。凍干粉加生理鹽水或PBS后放室溫30 min充分溶解，在溶液中的抗原應使用新配制的滅菌生理鹽水或PBS稀釋。免疫佐劑是指與抗原同時或預先注射到動物體內，可非特異性地增強機體對該抗原的免疫應答的物質 ，又稱為非特異性免疫增強劑。可溶性抗原較多采用佐劑免疫法，使抗原與佐劑混合制成穩定乳劑后用于羊駝免疫。顆粒性抗原多采用無佐劑免疫法，將顆粒抗原用PBS或生理鹽水制成混懸液（1%）進行免疫。
表一：常見佐劑種類以及其優勢和缺點。
常用的抗原乳化方法有乳缽研磨法、注射器推注法，超聲乳化法和機械攪拌法等多種[9]。抗原免疫佐劑最常用的是弗氏完全佐劑佐劑和弗氏不完全佐劑，二者的主要差別在于弗氏完全佐劑含有卡介苗，主要成分為礦物油和羊毛脂，它可以增強抗原的免疫原性以及改變機體的免疫反應性，達到增強免疫力或提高抗體產生水平以及使抗原在體內維持時間明顯延長等功效。抗原的乳化程度直接影響免疫效果，因此乳化后必須進行質量檢查。抗原與弗氏佐劑乳化后性狀形成油包水，乳化檢查的方法是：將制成的乳劑滴一滴在涼的自來水表面，質量合格的乳劑滴入水面后應保持乳滴珠完整不分散（見圖1）。
圖1
免疫動物的選擇
納米抗體制備的宿主動物一般選用羊駝[10-12]。動物的遺傳因素、營養狀況等因素直接影響到動物免疫應答的強弱。有的動物個體甚至有先天免疫缺陷，從而導致免疫失敗。動物維生素及氨基酸的缺乏都會使機體的免疫功能下降。環境衛生狀況不良，圈舍及周圍環境中存在大量病原微生物，在動物免疫期間受到病原的感染，這些都會影響免疫效果。免疫用的羊駝最好選擇2-3歲的年青成年動物，免疫系統發育成熟。特別要注意避免使用妊娠期的雌性動物用于制備免疫抗體。
羊駝免疫前的健康狀況：體重約50--70 kg，年齡在2-3歲左右；體格發育正常，營養狀況及精神狀態良好，羊駝背毛光亮；運動及行為無異常，無跛行、不協調等異常的肢勢，有警覺性及反應迅速；外部觀察無外傷，則可以進行后續的免疫實驗（見圖2）。免疫前用專用的牌子固定于羊駝的頸部，寫明羊駝的牌號，免疫前，還應采血測定動物體內有無滴度交叉反應性天然抗體的存在。為確保動物在整個免疫進程中的健康狀態，需要對羊駝來源，飼養環境需進行控制。由于對免疫應答的個別差異，免疫時可選用多只動物進行免疫。
圖2
免疫方案
實際操作中，免疫劑量、免疫部位以及免疫間隔時間的組合都會對免疫結果產生較大影響，需對免疫血清抗體效價進行監控，根據實際的免疫效果調整。
圖3
免疫途徑：不同的免疫途徑，包括淋巴結密集區皮下注射，和靜脈注射。 一般來說，皮下途徑優于靜脈途徑。因為靜脈注射的抗原首先進入脾臟，而皮下注射的抗原首先進入局部淋巴結。羊駝一般選用頸部淋巴節附近左右兩側進行多點注射。
免疫原劑量：免疫原的注射劑量隨抗原的性質有較大差異。一般應考慮抗原的免疫原性的強弱、分子量大小、抗原的純度以及動物個體的狀態、免疫途徑和免疫時間，佐劑的使用等做相應的調整。劑量過低，不能引起足夠強的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。一般而言，抗原量多，時間間隔長，劑量可適當加大。對于純的可溶性抗原，免疫時一般與等量的弗氏完全佐劑混合進行首次免疫，免疫劑量為500 μg，后續免疫劑量可以與首次劑量相同或為首次劑量的 1/2，顆粒性抗原（細胞）的免疫劑量為5*107-1*108/次。
免疫周期一般隨抗原和免疫方法的不同以及是否使用佐劑而變化，間隔時間可從數日到數周。初次免疫與加強免疫的間隔時間多為2周，免疫的總次數多為 4次，半抗原需經長時間的免疫才能達到高效價，可增加1-2次免疫。免疫時間和周期可參考表1羊駝免疫周期表。
測定抗體效價：一般情況下，在加強免疫后7-10天即可采血（見圖4），分離血清測定抗體效價。對于免疫性質不確定的小分子和多肽片段等半抗原，一般還應在初免后14天采血測定效價，以確定抗原的免疫原性和動物的反應性。抗體效價的測定方法有很多，常用的方法有ELISA和FACS。
圖4
表二：羊駝免疫周期表
圖5
本期文章引文
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